免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其陽性染色也在細(xì)胞核上。

2. DAB顯色時(shí)間需要達(dá)到*化，鏡下觀察達(dá)到陽性染色明顯但背景不太深。

3. 抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育溫度在4度。

4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時(shí)盡量畫大一點(diǎn)，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。

5. 片子著色不均勻的原因如下：

（1） 脫蠟不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；

（2）水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；

（3）抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；

（4） 抗體孵育時(shí)，切片放傾斜；

（5）抗體孵育后PBS沖洗不充分。

（6） 制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。

6. 一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？

（1） 一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

7. 切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

（1） 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制；

（2） 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

（3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

（5） DAB顯色時(shí)間過長或濃度過高；

（6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；

（7） 標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，易增強(qiáng)非特異性著色。