非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸探針的方法通常是通過在核酸分子中引入諸如半抗原、生物素等惰性小分子。這些小分子一般通過連接到dUTP等核苷三磷酸上。這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應(yīng)摻入到探針中，例如用于隨機(jī)引物法標(biāo)記長(zhǎng)鏈探針或是通過末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記寡核苷酸的3′端。

 

        雜交后用與一種酶相連接的抗體（或者如果是生物素，則用鏈霉抗生物素蛋白streptavidin）來檢測(cè)，這些酶如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶是用來催化所檢測(cè)反應(yīng)的。可使用的半抗原很多，zui常用的是地高辛、生物素與熒光素。本法比直接酶標(biāo)法步驟更多，因?yàn)槠渲邪さ姆庾琛?strong>抗體的結(jié)合及膜的洗滌等額外操作，但它可用在通過堿性磷酸酶催化底物二氧雜環(huán)烷（dioxetane）的高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)上，還能用于寡核苷酸探針上，即通過偶聯(lián)在探針上的辣根過氧化物酶催化的強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)，具有低本底與快速光輸出特點(diǎn)。

 

        熒光素作為半抗原用于核酸標(biāo)記探針有以下優(yōu)點(diǎn)：

        ①熒光素在雜交中很穩(wěn)定，甚至在較高溫度下也是如此。
　　②熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥ァ?br />　?、坩槍?duì)結(jié)合物中的熒光素部分可以制備高親和力的抗體。
　　④標(biāo)記的探針不用純化，因?yàn)楫?dāng)使用適當(dāng)?shù)姆庾鑴r(shí)，這種探針與膜的親和力很低。
　?、菔褂帽鞠到y(tǒng)時(shí)被抗體識(shí)別的內(nèi)源性物質(zhì)干擾的機(jī)會(huì)很小，但在原位雜交中如使用生物素則有干擾。
　?、逕晒馑赜米靼肟乖膠ui后一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是，在雜交開始之前就可知道探針標(biāo)記反應(yīng)能否成功，即通過快速（20 min）透射測(cè)定法測(cè)定所發(fā)出的天然熒光。監(jiān)測(cè)探針標(biāo)記的進(jìn)程與用β-計(jì)數(shù)器對(duì)32P標(biāo)記的探針檢測(cè)相似。

 

        熒光素基因顯影系統(tǒng)（fluorecein gene image system, Amersham International, Bucks, UK）就是利用熒光素作為半抗原，通過堿性磷酸酶催化二氧雜環(huán)烷的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。通過大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來催化的隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)使熒光素-11-dUTP摻入到DNA鏈中。

 

        在這個(gè)反應(yīng)中，Klenow片段特別有效，所以標(biāo)記過程可認(rèn)為是一個(gè)凈合成過程。例如50 ng的探針經(jīng)1 h合成后可行到300 ng的探針。標(biāo)記的探針不經(jīng)純化即可直接用于雜交試驗(yàn)中（先進(jìn)行變性處理）。雜交的嚴(yán)格性可通過雜交過程中鹽離子濃度或溫度的調(diào)節(jié)來控制，或/和通過嚴(yán)格性洗滌來控制。所推薦的探針濃度與ECL直接標(biāo)記系統(tǒng)相同：目標(biāo)DNA較少時(shí)使用10 ng/ml的濃度；目標(biāo)DNA較多時(shí)使用2~5 ng/ml的濃度。

 

        如果在雜交階級(jí)中以及在隨后加入抗體結(jié)合物前的膜封阻步驟中使用的是固體封阻劑，就可能因封阻劑難溶而造成程度不等的背景。使用封阻劑濃縮液可保證試劑的一致性和低本底。對(duì)抗體結(jié)合物制備進(jìn)行優(yōu)化及使用抗熒光素的單克隆抗體可進(jìn)一步降低本底，提高信噪比。