等電聚焦電泳法實驗過程

一、實驗?zāi)康?br />了解等電聚焦的原理.通過蛋白質(zhì)等電點的測定,掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直管式等電聚焦電泳技術(shù).

二、實驗原理
等電聚焦(Isoelectric focusing,簡稱IEF)是六十年代中期出現(xiàn)的新技術(shù).近年來等電聚焦技術(shù)有了新的進(jìn)展,已迅速發(fā)展成為一門成熟的近代生化實驗技術(shù).目前等電聚焦技術(shù)已可以分辨等電點(pI)只差0.001pH單位的生物分子.由于其分辨力高,重復(fù)性好,樣品容量大,操作簡便迅速,在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用.
蛋白質(zhì)分子是典型的兩性電解質(zhì)分子.它在大于其等電點的pH環(huán)境中解離成帶負(fù)電荷的陰離子,向電場的正極泳動,在小于其等電點的pH環(huán)境中解離成帶正由荷的陽離子,向電場的負(fù)極泳動.這種泳動只有在等于其等電點的pH環(huán)境中,即蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時才能停止.如果在一個有pH梯度的環(huán)境中,對各種不同等電點的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳,則在電場作用下,不管這些蛋白質(zhì)分子的原始分布如何,各種蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度中相對應(yīng)的位置處進(jìn)行聚焦,經(jīng)過一定時間的電泳以后,不同等電點的蛋白質(zhì)分子便分別聚焦于不同的位置.這種按等電點的大小,生物分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”.等電聚焦的特點就在于它利用了一種稱為兩性電解質(zhì)載體的物質(zhì)在電場中構(gòu)成連續(xù)的pH梯度,使蛋白質(zhì)或其他具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品進(jìn)行聚焦,從而達(dá)到分離、測定和鑒定的目的.
兩性電解質(zhì)載體,實際上是許多異構(gòu)和同系物的混合物,它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物,分子量在300~1000之間.常用的進(jìn)口兩性電解質(zhì)為瑞典Pharmacia-LKB公司生產(chǎn)的Ampholine 和Pharmalyte,價格昂貴.國產(chǎn)的有中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所和上海生化所生產(chǎn)的兩性電解質(zhì),價格便宜,質(zhì)量尚佳.兩性電解質(zhì)在直流電場的作用下,能形成一個從正極到負(fù)極的pH值逐漸升高的平滑連續(xù)的pH梯度.若不同的pH值的兩性電解質(zhì)的含量與pI值的分布越均勻,則pH梯度的線性就越好.對Ampholine兩性電解質(zhì)的要求是緩沖能力強(qiáng),有良好的導(dǎo)電性,分子量要小,不干擾被分析的樣品等.
在聚焦過程中和聚焦結(jié)束取消了外加電場后,如保持pH梯度的穩(wěn)定是極為重要的.為了防止擴(kuò)散,穩(wěn)定pH梯度,就必須加入一種抗對流和擴(kuò)散的支持介質(zhì),zui常用的這種支持介質(zhì)就是聚丙烯酰胺凝膠.當(dāng)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳時,凝膠柱內(nèi)即產(chǎn)生pH梯度,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品電泳到凝膠柱內(nèi)某一部位,而此部位的pH值正好等于該蛋白質(zhì)的等電點時,該蛋白質(zhì)即聚焦形成一條區(qū)帶,只要測出此區(qū)帶所處部位的pH值,即為其等電點.電泳時間越長,蛋白質(zhì)聚焦的區(qū)帶就越集中,越狹窄,因而提高了分辨率.這是等電聚焦的一大優(yōu)點,不像一般的其他電泳,電泳時間過長則區(qū)帶擴(kuò)散.所以等電聚焦電泳法不僅可以測定等電點,而且能將不同等電點的混合的生物大分子進(jìn)行分離和鑒定.
早期的等電聚焦電泳是垂直管式的,其特點是體系是封閉的,不與空氣接觸,可防止樣品氧化.近年來,又發(fā)展了超薄層水平板式等電聚焦電泳.此法的優(yōu)點是加樣數(shù)量多,節(jié)省兩性電解質(zhì),電泳后固定、染色、干燥都十分迅速簡便,其zui大優(yōu)點是防止了電極液的電滲作用而引起正負(fù)兩極pH梯度的漂變.
測定pH梯度的方法有四種：
1.將膠條切成小塊,用水浸泡后,用精密pH試紙或進(jìn)口的細(xì)長pH復(fù)合電極測定pH值,然后作圖.
2.用表面pH微電極直接測定膠條各部分的pH值,然后作圖.
3.用一套已知不同的pI值的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn),測定pH梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.
4.將膠條于－70℃冰凍后切成1mm的薄片,加入0.5ml 0.01M KCl,用微電極測其pH.

三、儀器和用具
1.電泳儀
2.垂直管式園盤電泳槽一套
3.注射器與針頭
4.移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml
5.小燒杯若干
6.培養(yǎng)皿一套
7.直尺
8.小刀
9.精密pH試紙和帶細(xì)長復(fù)合pH電極的pH計
10.塑料薄膜和橡皮筋

四、試劑
1.丙烯酰胺
2.甲叉雙丙烯酰胺
3.兩性電解質(zhì)
Ampholine(40%,pH3.5~9.5)
4.過liu酸胺(催化劑)
5.TEMED(四甲基乙二胺)(加速劑)
6.磷酸
7.NaOH
8.三lv乙酸(TCA)

五、溶液配制
1.丙烯酰胺貯液(30%丙烯酰胺,交聯(lián)度2.6%)：,30g丙烯酰胺和0.8g甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O,定容至100ml,濾去不溶物后存于棕色瓶,4℃可保存數(shù)月.(全班公用)(另一配方為29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O,定容至100ml,交聯(lián)度為
3.0%).
2.兩性電解質(zhì)Amphline(40%)的加入量為：50ml /ml 膠液.
3.過liu酸胺：配成1mg/ml的濃度,當(dāng)天配制,配100ml全班公用.膠液中的加入量為0.5mg/ml膠液.
4.TEMED：膠液中的加入量為1ml/ml膠液.
5.蛋白質(zhì)樣品：選用兩種等電點相差較大的蛋白質(zhì),每根垂直管中每種蛋白質(zhì)的加樣量控制在<100mg.蛋白質(zhì)樣品配制成各為5mg/ml的濃度.配2.5ml全班公用.
6.固定液：10%的三lv乙酸,每組配50ml .
7.陽極電極液：0.1M H3PO4
3.4ml 濃磷酸(85%)加H2O至500ml,每個電泳槽用500ml.
8.陰極電極液：0.5M NaOH
2g NaOH 加H2O溶解至500ml,每個電泳槽用500ml.

等電點標(biāo)準(zhǔn)品，GE試劑，貨號17047101，常備貨。