地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針

1．標(biāo)記DNA探針 每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3?線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

（1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：

新鮮變性的DNA 1-3?

六聚核苷酸混合物 2?（管5）

dNTP標(biāo)記用混合底物 2?（管6）

加無(wú)菌重蒸水至 19?

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow） 1?（管7）

（3）在37℃保溫至少60min，可到20h。

（4）煮沸5min，終止反應(yīng)。

（5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。

2．預(yù)雜交 按100cm2膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。

預(yù)雜交液組成：5?SC

0.5%（W/V）封阻試劑（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過(guò)夜。

3．雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。

雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）

5%（W/V）封阻試劑

5?SC

0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

0．02%（W/V）SDS

新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml）

雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過(guò)夜（16～20h）。

4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。

（1）在室溫下用2?SC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

（2）在65℃條件下用0.1?SC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

（3）在室溫下用2?SC溶液漂洗1次。

5．免疫測(cè)定

（1）配制溶液

緩沖液1：Tris-HCl（100mmol/L）;NaCl（150mmol/L）pH7.5（20℃）

緩沖液2：0.5%（W/V）封阻試劑（管11）,配制于緩沖液1中（封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁）。

緩沖液3：Tris-HCI（100mmol/L）;NaCI（100mmol/L）;MgCI2（500mmol/L）pH9.5（20℃）。

緩沖液4：Tris-HCl（10mmol/l）;EDTA（1mmol/L）;pH8.0（20℃）

顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45?NBT溶液（管9）和35?X-磷酸鹽緩沖液（管10）。

2． 顯色過(guò)程

A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。

B．在100ml緩沖2中保溫30min。

C．再用緩沖液1短暫洗滌。