LightCycler應(yīng)用--甲基化分析

主要應(yīng)用:
應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一，它可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的表達(dá)。具體的過(guò)程是在胞嘧啶－鳥(niǎo)嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一個(gè)額外的甲基團(tuán)，形成5－甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度較高的區(qū)域在人體基因組中呈非隨機(jī)分布于，優(yōu)先分布于基因的啟動(dòng)子區(qū)，并被稱為CpG島[1]。對(duì)于癌癥，其基因組的甲基化分布發(fā)生變化[2]。正常狀態(tài)下應(yīng)甲基化的區(qū)域未甲基化，而癥狀狀態(tài)下非甲基化區(qū)域出現(xiàn)甲基化，例如CpG島相關(guān)啟動(dòng)子呈超甲基化。這可導(dǎo)致受累基因座的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使基因沉默。啟動(dòng)子超甲基化可導(dǎo)致有關(guān)腫瘤演進(jìn)的重要基因再次沉默，例如那些有關(guān)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡的基因。因此，可以認(rèn)為DNA甲基化與腫瘤研究密切相關(guān)。腫瘤中某些基因的DNA甲基化狀態(tài)的變化通過(guò)其生物學(xué)特征反映出來(lái)。因此，評(píng)估DNA甲基化的快速高通量方法對(duì)研究者和臨床醫(yī)生在診斷、治療和預(yù)后都非常有實(shí)用價(jià)值[3].
當(dāng)前對(duì)于DNA甲基化研究，普遍使用的方法有甲基化特異性PCR，變性液相色譜法（DHPLC），聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法（COBRA）等，這些方法各有優(yōu)勢(shì)，但是均存在諸如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，易產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性等問(wèn)題，提示科學(xué)家尋找更加容易且準(zhǔn)確的分析手段。
甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）是近年興起的一種適用于評(píng)估特定基因DNA甲基化的新技術(shù)[4]。它基于當(dāng)前實(shí)時(shí)熒光PCR儀器的前沿應(yīng)用 – 高分辨率熔解曲線分析（HRM），使用既可擴(kuò)增甲基化序列也可擴(kuò)增非甲基化序列的引物對(duì)來(lái)自經(jīng)重亞硫酸鹽修飾的DNA的相關(guān)區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重亞硫酸鹽修飾DNA，讓非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不變，隨后通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)感興趣區(qū)域的甲基化狀態(tài)。在MS-HRM中，在飽和的DNA結(jié)合染料存在的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng)，在擴(kuò)增后進(jìn)行高分辨熔解曲線分析，HRM分析的特點(diǎn)為可以區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物中少至1個(gè)堿基變化的序列差異，從而通過(guò)尿嘧啶/胞嘧啶的差異判斷擴(kuò)增子來(lái)源于甲基化還是非甲基化的初始模板變異體。MS-HRM可評(píng)估引物之間整條擴(kuò)增子的甲基化狀態(tài)。由于它是一種閉管方法，可初步快速評(píng)估甲基化。相比于傳統(tǒng)的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量靈活（zui多一次篩查384個(gè)樣本，zui少幾個(gè)樣本），并且準(zhǔn)確率大大提升。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的特征熔解曲線，還可以對(duì)樣本中存在的甲基化DNA比率進(jìn)行基本的定量。
更多有關(guān)特定CpG位點(diǎn)的甲基化的詳細(xì)信息，可采用重亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序分析。
我們使用羅氏診斷公司的LightCycler®480高分辨熔解擴(kuò)增試劑盒在LightCycler®480實(shí)時(shí)熒光PCR儀上，通過(guò)MS-HRM測(cè)定法對(duì)兩種已知的經(jīng)過(guò)啟動(dòng)子（FANCE和MGMT）甲基化的DNA修復(fù)基因的檢測(cè)性能。
材料和方法
將多種細(xì)胞株的DNA樣本作為檢測(cè)模板。每μg的每種DNA樣本都經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽修飾。通過(guò)在正常DNA（經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽修飾）池中按50％、25％、10%、5％和1％稀釋100％的甲基化對(duì)照DNA（經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽修飾）以創(chuàng)建甲基化標(biāo)準(zhǔn)品。MS-HRM引物按Wojdacz和Hansen描述的方法設(shè)計(jì)[5]。使用LightCycler®480高分辨熔解擴(kuò)增試劑盒在96孔LightCycler®480儀器中執(zhí)行擴(kuò)增和熔解反應(yīng)。

圖1：（a）含100％甲基化和非甲基化質(zhì)控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的FANCE MS-HRM測(cè)定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數(shù)據(jù)。（b）含100％甲基化和非甲基化質(zhì)控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的MGMT MS-HRM測(cè)定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因掃描”軟件模塊分析的數(shù)據(jù)。

圖2：（a）FANCF MS-HRM測(cè)定，顯示稀釋卵巢癌細(xì)胞株2008中存在DNA甲基化。（b）MGMT MS-HRM測(cè)定，顯示乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB435和HS578T中存在甲基化。

結(jié)果和討論:
針對(duì)兩個(gè)基因的MS-HRM測(cè)定法都可檢出非甲基化DNA背景下1％的甲基化DNA。圖1顯示MGMT的測(cè)定和FANCF測(cè)定相比，在該試驗(yàn)使用的引物退火溫度（58℃）條件下可更加明確的識(shí)別稀釋比更低的甲基化標(biāo)準(zhǔn)品。圖2顯示使用FANCF和MGMT MS-HRM測(cè)定法篩查多種細(xì)胞株的甲基化狀態(tài)。圖2a顯示通過(guò)FANCF篩查的九種細(xì)胞株中只有卵巢癌細(xì)胞株2008存在甲基化，其樣本熔解特征曲線與100％的甲基化質(zhì)控品相似。研究的其它細(xì)胞株通過(guò)FANCF檢測(cè)為非甲基化結(jié)果。圖2b顯示通過(guò)MGMT檢測(cè)出乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB435存在甲基化。該樣本的曲線特征再次與100％的甲基化質(zhì)控品相似。HS578T乳腺癌細(xì)胞株非常有趣，因?yàn)樗娜劢馇€與非甲基化和甲基化曲線都不同。該曲線以檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)異質(zhì)性甲基化為特征。
LightCycler® 480實(shí)時(shí)熒光PCR儀是一款非常適合進(jìn)行HRM的實(shí)時(shí)熒光PCR儀器，配合使用LightCycler® 480高分辨熔解擴(kuò)增試劑盒，即成為了一套執(zhí)行甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）檢測(cè)的可靠平臺(tái)，允許快速高通量研究DNA甲基化。相信這個(gè)新的研究方法的推出可以有效加快表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)程，做到更快、更準(zhǔn)、更好。