細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

　1.冷凍管應(yīng)如何解凍？
　　
　　取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。
　　
　 2.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
　　
　　除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
　　
　　3.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？
　　
　　不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
　　
　　4.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？
　　 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。
　　
　　5.何謂FBS,FCS,CS,HS?
　　 FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS（calfserum）則是指小牛血清。HS（horseserum）則是指馬血清。
　　
　　6.培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？
　　
　 　一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
　　
　　7.何時須更換培養(yǎng)基？
　　
　　視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
　　
　　8.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
　　
　　9.附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？
　　
　　一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會。
　　
　　10.懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？
　　
　　一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
　　
　　11.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
　　
　　欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg（約1,000rpm），5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
　　
　　12.細(xì)胞之接種密度為何？依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
　　
　　13.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
　　
　　動物細(xì)胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO（dimethylsulfoxide）和90-95%原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
　　
　　14.DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？
　　
　 　冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissueculturegrade之DMSO（如SigmaD2650），其本身即為無菌狀況，次開瓶后應(yīng)立即 少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之 Nylon材質(zhì)濾膜。
　　
　　15.冷凍保存細(xì)胞之方法？
　　

  冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30~60分鐘→（-20°C30分鐘*）→-80°C16~18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。
　　

  冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
　　
　　16.細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
　　
　　冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。
　　
　　17.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。
　　
　　18.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？
　　
　　直接滅菌后丟棄之。
　　
　　19.支原體（mycoplasma）污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
　　
　　不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，
　　
　　無法以其外觀分辨之。
　　
　　20.支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
　　
　　支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
　　
　　21.偵測出細(xì)胞株有支原體污染時，該如何處理？
　　
　　直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。
　　
　　22.CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
　　
　　定期（至少每兩周一次）以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
　　
　　23.為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？
　　
　　培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenolred）的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。
　　
　　24.各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？
　　
　　不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
　　
　　25.購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
　　
　　研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
　　
　　26.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
　　
　　研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80°C太久。
　　
　　27.收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
　　
　　冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊.